研究技术———

2-D双向电泳:

蛋白质组学中对蛋白质组进行研究的主要分离方法,虽然为精细手工,非高通量技术,但是目前唯一的同时能分离成百上千种蛋白质的工具。蛋白质在第一向根据电荷的不同,第二向根据分子量的不同进行分离。样品(细胞、组织提取液)溶解后,蛋白质混合物通过等电聚焦进行分离,在电流的作用下在固定的聚丙烯酰胺PH胶条上移动,直到迁移到其等电点处。然后将第一向胶转到聚丙烯酰胺胶的第二向上,根据分子量的不同进行分离。分离后对蛋白质进行染色,根据实际分析情况,分别进行考马斯亮兰染色、银染或荧光染色。扫描后用相关软件(PDQUEST等)进行图谱分析,分析差别点等。
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MS质谱技术:

质谱技术的基本原理是样品分子离子化后,根据不同离子间质荷比(m/z)的差异来分析蛋白质和多肽的分子量和对蛋白质进行鉴定,磷酸化蛋白质分析、糖基化蛋白质分析、ICAT差异定量、多肽DE NOVO序列分析、复杂蛋白质混合物酶解和shotgun鉴定。一台质谱仪一般有进样装置,离子化源,质量分析器,离子检测器和数据分析系统组成。MALDI-MS和ESI-MS逐渐成为蛋白质和多肽分析中最重要的方法。MALDI基质辅助激光解吸离子化是将样品均匀包埋在固体基质中,基质吸收激光提供的能量而蒸发,携带部分样品分子进入气相,并将一部分能量传递给样品分子使其离子化,这种质谱仪的特点是可分析分子量较大的分子,对杂质的忍耐性较好。ESI-电喷雾质谱仪,通过样品溶液在毛细管喷雾口形成液滴,在强电场和热的干燥气的共同作用下,液滴逐渐被气化,同时也被质子化;喷雾口与离子聚焦传输区之间的压力差推动质子化样品进入质量分析器进行检测。
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N,C-端测序:聽

主要进行蛋白质一级结构的对蛋白质进行N,C端测序有主要二个步骤,第一步,采用化学法把氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来;第二步,在氨基酸上衍生一个生色基团,通过高效液相色谱进行分离分析。N端测序采用的是Edman降解的方法,通过蛋白质和多肽的自由α-氨基与PITC偶联、裂解、转化成PTH-AA,经过C-18反相柱进行分离。C端测序基于与N端Edman降解类似的原理,通过蛋白质和多肽的α-羧基与化学试剂活化、烷基化、裂解,反应后的衍生物被切割下来,通过HPLC系统进行分离分析。
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蛋白质纯化:

主要采用色谱仪(HPLC 、2DLC)对细胞或组织中的蛋白质混合物,根据蛋白质的极性,疏水性或与配体亲和能力对蛋白质进行分离。包括离子交换色谱,疏水色谱,亲和色谱。而二维色谱系统(2DLC)为阳离子交换柱和反相色谱柱(或者是阴离子交换柱和反相色谱柱)联用的方式蛋白质混合物进行粗分离,各组蛋白质混合物最终是在多维色谱中是从反相柱中被洗脱下来,同时完成脱盐,去除杂质的步骤,减少蛋白质在纯化过程中的损失。
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