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转个帖子,谁能从头到尾完成它的提问,那真是牛×呀,哈哈!

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作者 留言
上帝没有手
原子


注册时间: 2003-07-10
帖子: 13

帖子发表于: Tue Dec 02, 2003 1:57 am聽 聽发表主题: 转个帖子,谁能从头到尾完成它的提问,那真是牛×呀,哈哈! 引用并回复

转自丁香园pengkp

蟑螂是活化石

2003-08-22 00:53 蛋白胶内消化及质谱分析集中讨论

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从2D胶上挖下的点不少,可是就是无法得到理想的质谱结果,真是让人苦恼,各位做蛋白质组的同道,一起讨论一下,把您的经验和遇到的问题以及解决方案给大家介绍一下。
先在此提出一些问题
1,待作质谱分析的PAGE胶保存方法。
2,4度保存的PAGE胶半年时间(或其它时间)后还可以做质谱分析吗?
3,手工切胶时使用的工具。我是用注射器把针头前端磨平,然后硅烷化。
4,切胶后是否一定需要切成1mm3的小块,如何切碎?切碎后如果被枪头吸掉如何解决?
5,银染和考染凝胶块的脱色方案。脱色时间,次数,脱色液成分等
6,使用碳酸氢铵缓冲液的浓度,25mM, 50mM, 100mM,经常使用哪个,感觉效果如何?
7,trypsin使用量。是根据胶块大小,还是根据估计蛋白含量,或其它?
8,如何进行消化?
9,是否需要考虑溶胀凝胶用液体的体积?如果是,加trypsin的体积是多少?
10,加trypsin后是否应放4度一段时间,如果是,要多长时间?
11,如果加trypsin的体积太少,是否应补充碳酸氢铵buffer,以使凝胶充分溶胀?
12,消化用溶液的体积是否应该超过凝胶体积?即是否应该使凝胶完全浸没在溶液中?还是只要使凝胶充分溶胀即可,而不需浸没凝胶。
13,消化时间如何掌握?以使消化充分而自切峰少。
14,不同来源酶的效果如何?
15,从消化完的凝胶中抽提肽片段的方案。抽提溶液组成,抽提几次,抽提温度。超生对抽提帮助有多大?
16,抽提溶液抽真空方案。有人建议不要将抽提液完全抽干,是否有意义?因为如果一次抽很多样品,根本无法保证抽的速度完全一致,可能有的已干,而有的还有很多液体。
17,溶解抽干消化产物的方案。溶解液组成,加入量。如果作MALDI,是否可以将matrix solution直接加入抽干产物中。如果是作ESI,溶解液中使用TFA,而LC用溶液中使用甲酸,是否会对结果有影响?
18,MALDI点靶方案。
好了,暂时只想到这么多。各位同道可以针对以上问题提出自己的解决方案,也可以把自己的经验教训告诉大家,或者提出自己的问题。
谢谢丁香园提供这个空间,使我们能在此共同学习提高。

补充:可以检测到的蛋白量范围是多少?是否考染可以看到的点都可以质谱鉴定出来?银染点鉴定效果如何?


pengkp edited on 2003-08-22 00:57
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Qstar



注册时间: 2004-03-13
帖子: 4

帖子发表于: Sat Mar 13, 2004 4:40 am聽 聽发表主题: 引用并回复

If you really want to know the answer, you can label the standard protein by isotope (I-135?) and monitor the sample loss and recovery at each step. I remember sombody has done so and claimed they got over 50% recovery from their in-gel digestion protocol. Make sure you use mass-spec compatible silver stain (aldyhyde free) if you really want to use it. Sypro ruby stain is another alternative, easy to use and with almost the same sensitivity as silver stain. But it's fluoroscence dye and the protein spots must be illuminated by UV.
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yuanchao
原子


注册时间: 2003-07-09
帖子: 11

帖子发表于: Sun Apr 25, 2004 3:25 pm聽 聽发表主题: Dark Reader 引用并回复

The Ruby stained gels can also be visualized with a dark reader. See http://www.clarechemical.com/transilluminator.htm for more inforamtion.
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straw
Site Admin


注册时间: 2003-05-28
帖子: 47

帖子发表于: Thu Apr 29, 2004 9:23 am聽 聽发表主题: 引用并回复

哈哈,大虾,最近在米果生活得怎么样呀?
_________________
我最近的作品
http://www.proteomics.ac.cn/2D/
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